DNA, canlıların biyolojik varlığı için gerekli olan genetik talimatları taşıyan nükleik asittir. Hücrenin yönetici molekülüdür. DNA içerisinde bulunan bilgiler (genler) RNA’ya kodlanır. RNA’da bulunan bilgiler ise protein olarak ifade edilir. 1953 yılında DNA’nın yapısı Rosalind Franklin, Francis Crick ve James Watson tarafından keşfedildi. DNA çift sarmaldan oluşmaktadır. Bir sarmalda 4 çeşit baz bulunabilir; Adenin, sitozin, guanin ve timin. Adenin timin ile guanin de sitozin ile bağ kurabilir. Bazların farklı bağlanma sıraları, farklı sayıları genetik çeşitliliği oluşturur.

Şekil 1: DNA’nın yapısı

DNA dizileme, DNA’nın nükleotidlerinin sıralamasının belirlenmesidir. Bu sayede canlıların genetiğini öğrenerek, biyolojik yapı ve aktivitelerini incelemeyi sağlar. Bu yöntem mikrobiyoloji, tıbbı tanı koyma, adli tıp, genetik hastalıkların tespiti için kullanılmaktadır.

Genlerin dizilenmesi sayesinde evrimsel biyolojinin öngördükleri, ilk defa genetik olarak da doğrudan test edilebilmiştir. İnsan genomunun dizilenmesi genetik hastalıkların tedavisi için de çok önemlidir.

Basit Dizileme Yöntemleri

1- Sanger Metodu

Frederick Sange bir virüsün genom dizisini ortaya çıkardı. Kendi adıyla anılan yöntem 1980’de Kimya Nobel Ödülü’ne layık görüldü.

Zincirin sentezini sonlandırmaya yarayan dideoksinükleotidler(ddNTP) kullanılır. Dideoksinükleotidlein deoksinukleotidlerden farkı 3’OH grubu yerine 3’H grubu içermesidir.   Sona gelen ddNTP’ler floresan boya ile boyanarak tek iplikli bir kalıp DNA, DNA’nın kendini klonlamasını sağlayacak olan DNA polimeraz, ddNTP’ler, zincir büyümesini sonlandıran modifiye edilmiş bazlar kullanılır. Bu bazlar dizileme yapmak için radyoaktif olarak işaretlenir. Her baz farklı renkte ışıma yapar. Işımanın dalga boyu detektör ve bilgisayar tarafından algılanır. Dalga boyuna göre nükleotid belirlenir. Zincirin sonuna 3’H grubu eklenirse nükleotid diğer nükleotid ile bağ kuramaz, DNA zinciri daha fazla uzayamaz ve reaksiyon sona erer. Böylece elimizde farklı uzunluklar DNA zincirleri bulunur.

Şekil 2: Sanger Dizileme Yöntemi

2- Maxam – Gilbert Dizilemesi

 1977 yılında, Harvard Üniversitesi’nden Alan Maxam ve Walter Gilbert tarafından, DNA’nın kimyasal modifikasyonu ve DNA’nın kesilmesidir. DNA’yı kesmek için kimyasalların (Hidrazin, dimetil sülfat ya da formik asit) kullanılır. 4 ayrı reaksiyon ile saflaştırılmış DNA dizilenebilir. Karmaşık bir yöntemdir. Zararlı kimyasallar kullanmayı gerektirir. Bu yüzden moleküler biyoloji çalışmalarında kullanılamaz.

Şekil 3: Maxam–Gilbert Dizileme

 Maxam – Gilbert Dizileme Metodları:

  1.  DNA zincirinin 5’ ucunda bulunan fosfat grubunun radyoaktif fosfat (32P) ile işaretlenir ve DNA saflaştırılır.
  2.  G, A+G, C ve C+T nükleotidlerinin muamelesini içeren 4 farklı kimyasal reaksiyon seti şeklinde, bu nükleotidlerin bulundukları DNA konumundan kesikler oluşturulur. Belirli modifikasyonları sağlayan enzimlerin farklı konsantrasyonlarda kullanılmasıyla her DNA molekülü başına az sayıda modifikasyon oluşması sağlanır.
  3.  Modifiye olmuş DNA parçaları kesilerek elektroforeze sokulur ve 4 farklı reaksiyonu ifade eden 4 farklı kolondaki bantlara göre aşağıdan yukarıya yani kısa zincirlerden uzun zincirlere doğru okuma yapılır.

DNA’yı işaretleyerek DNA’nın çoğaltılmasına gerek olmadan yapılır.

İleri Dizileme Yöntemleri

Bu yöntemler genel olarak tüm kromozom dizilemelerinde kullanılır.

1– Av Tüfeği Dizileme

DNA dizileri çok sayıda rastgele küçük parça olarak okunur. DNA birkaç kez okumanın ardından parçalar halinde dizilenir. Farklı okumaların üst üste gelen bölümleri bir araya getirilir. Okumaların hiçbiri orijinal dizinin tamamı değildir. Tekrarlayan dizilerin çok olması birleştirmeyi zorlaştırır. Bunun için orijinal DNA birçok kez okuma gerçekleştirilerek dizilenir.

Şekil 4: Av Tüfeği Dizileme

2– PCR Köprüsü

Laboratuvar koşullarında yapılan klonlama ile elde edilen dizileme yöntemidir. Yüksek ısıya maruz kalan DNA’nın iki zinciri ayrılır. Daha sonra sıcaklık düşürülerek nükleotidler DNA’ya bağlanır. Sonraki aşamada sıcaklık tekrar yükseltilir (72°C) DNA’ya bağlanan kısa nükleotid dizilerine yenilerinin eklenmesi sağlanır. Bu metot Illumnia Genom Analiz Dizileme şirketince kullanılır. Ucuz ve hızlı bir yöntemdir.

Yeni Nesil Dizileme Yöntemleri

Yeni nesil yöntemler eskilerinin aksine tek seferde milyonlarca dizi üretebiliyor.

1 – Kitlesel Paralel Dizileme

1990’larda Lynx Therapeutics’te geliştirildi. MPSS, bağlama ve şifre çözme adımlarını içerir. Dizi dört nükleotidlik birimler halinde okunur.

2 – Poloni Dizileme

Harvard’da George Church’ün laboratuvarında geliştirildi. Birçok dizileme yöntemde kullanılan özellikleri birleştirerek bir E. coli genomunu yüksek bir doğrulukla üretebildi. Maliyeti Sanger dizilemesinin yaklaşık 1/10’uydu.

Şekil 5: Poloni Dizileme

3 – Solexa Dizilemesi

Solexa, tersinir boya sonlandırıcılarına dayanan dizileme teknolojisini geliştirmiştir. 4 Nükleotidin her biri farklı renge boyanır. DNA molekülleri çoğaltılarak koloniler oluştururlar. Boyanmış dört tip baz eklenir.  Floresan işaretli nükleotidlerin rengine göre dizilim belirlenir. Kısa okumalar yapar.

4 – DNA Nanotop Dizilemesi

Complete Genomics şirketi tarafından geliştirildi. Dönen çember ikileşmesi kullanarak DNA’dan elde edilmiş küçük parçaları çoğaltıp bunlardan DNA nanotopları meydana getirmektedir. Bağlanma yoluyla dizilenir. Tek seferde çok sayıda DNA nanotoplarının dizileyebilir. Düşük maliyetlidir. Her bir DNA nanotopundan sadece kısa diziler elde edilir.

5 – 454 Pirodizilemesi

Sentez bağlı dizileme yöntemidir. 1993 yılında Bertil Petterson, Mathias Uhlen ve Pal Nyren tarafından tasarlandı. Bu yöntemde bir yağ çözeltisi içindeki su damlacıklarında yer alan DNA, PCR ile çoğaltılır. Tek bir DNA ipliğinden tamamlayıcı zincir boyunca ortama eklenen nükleotid bilinerek tek tek dizilim oluşturulur. Pirodizilemede lüsiferaz enzimi kullanılır, bu enzimin ürettiği ışık ile dizilenen DNA’nın sonraki nükleotidi tespit edilir. Veriler birleştirilerek dizi okumaları üretilir. Diğer yöntemlerden hızlıdır. Hata oranı düşüktür. Orta uzunlukta diziler üretir. Maliyeti yüksek değildir.

6 – SOLiD Dizileme

 SOLiD ‘Life Technology’ tarafından bağlanma yoluyla dizileme yöntemi gelişirildi. Belli uzunluktaki birkaç nükleotidden oluşmuş DNA parçaları karışımı dizilenen konuma göre işaretlenir. Dizilemeden önce DNA, PCR ile çoğaltılır. Elde edilen parçaların her birinde aynı DNA’nın kopyaları bulunmaktadır. Nükleotidler iki ligasyon (Bir enzim yardımıyla iki DNA parçası bağlanır.) sonrasında renk analizine göre belirlenir. Her bazı iki defa kontrol eden mekanizmaya sahiptir. Bu yüzden güvenilirliği fazladır.

Şekil 6: SOLiD Dizileme

7 – İyon Yarı İletken Dizilemesi

2007 yılında Ion Torrent Systems şirketinde Jonathan Rothberg tarafından geliştirildi. Bu yöntem, DNA’nın oluşumu sırasında açığa çıkan hidrojen iyonlarının tespitine dayalıdır. Dizilenecek bir kalıp DNA ipliği içeren bir mikro-kuyu, tek bir nükleotit tipi ile doldurulur. Eklenen nükleotit uzayan zincire dâhil edilebiliyorsa hidrojen iyonunu açığa çıkar. Hidrojen konsantrasyonu sensörün pozitif voltaj farklılığına yol açar.  Eğer kalıp dizide aynı nükleotitten peş peşe birkaç tane varsa, bir döngüde birden çok nükleotid zincire katılacaktır. Serbest kalan hidrojen iyonu sayısı arttıkça orantılı olarak daha yüksek bir elektronik sinyal elde edilir.

Sekanslama sırasında değiştirilmiş enzim ve nükleotidler kullanılmaz. Hızlı bir dizilme yöntemidir. Küçük genomları diziler. Maliyeti düşüktür. Fakat eğer DNA’da çok fazla peş peşe aynı baz görülüyor (homopolimer) ise açığa çok fazla hidrojen çıkacağı için kaç tane aynı nükleotid olacağı kesin olarak belirlenemez.

Kaynakça

Görsel Kaynakları