CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ya da Düzenli Aralıklarla Bölünmüş Palindromik Tekrar Kümeleri, bakterilerin kendilerini bakteriyofajların saldırılarından korumak için kullandıkları bir savunma sistemi olarak işlev gören ve kısa tekrarlı baz dizileri içeren prokaryot DNA segmentleridir. CRISPR-CAS (CRISPR ilişkili) sistemleri, prokaryotlarda enfeksiyöz ajanlara adaptif bağışıklık kazandırır. CRISPR-CAS aktivitesine, enfekte edici bir fajın genomunu parçalamak gibi yabancı bir nükleik asidi denetleyebilen ve susturabilen RNA eşlikli efektör proteinler aracılık eder. Programlanabilir doğası ve güçlü endonükleaz aktivitesi nedeniyle, Cas9 gibi Sınıf 2 tek efektör Cas proteinleri artık genomları düzenleme ve daha geniş anlamda istenen herhangi bir aktiviteyi bir hücrenin genomuna lokalize etme yeteneğimizde devrim yaratıyor. Bu nedenle araştırmacılar tarafından, Cas proteinlerinin geniş faydasının kavranılması, daha yüksek aktivite, terapötik dağıtım potansiyeli, nükleik asit tespiti vb. gibi gelişmiş fonksiyonlara sahip Cas varyantlarını bulmak ve prokaryotik konakçı ve patojen arasındaki evrimsel silahlanma yarışından kaynaklanmış bu yüksek işlevselleştirilmiş efektör sistemlerin nasıl ortaya çıktığını anlamak için bir araştırma başlatıldı.
Araştırma Verileri
Filogenetik analiz, DNA’ya bağlayıcı Sınıf 2 Cas proteinlerinin, RuvC benzeri bir endonükleaz alanının imzasına sahip olan bir ata genden evrimleştiğini ileri sürer. Yakın tarihli bir makalede, Doudna, Banfield ve meslektaşları, Cas evrim sürecinin bir anlık görüntüsünü temsil eden ve şaşırtıcı bir şekilde, şimdiye kadar karakterize edilen Cas proteinlerine göre çeşitli biyoteknolojik avantajlar sunan daha basit ve daha küçük bir Cas proteini tanımlamak için bu mantığı kullanıyor. Kısaca, araştırmacılar, RuvC benzeri bir alana sahip olan ve bir CRISPR lokusunun yakınında bulunan genler için terabaz ölçekli sekanslama veri setlerini eleyerek, oldukça yeni varsayılan tek efektör Cas proteini tanımladılar. Cas14’ler olarak adlandırılan bu varyantlar, iyi karakterize edilmiş Cas12a proteini ve yakın zamanda keşfedilen CasX varyantı dahil olmak üzere diğer Tip V Cas proteinlerini andırıyor, ancak Sınıf 2 varyantlarının tipik ≥1000 amino asidi yerine kabaca 400-700 amino asit olan son derece küçük boyutlarıyla dikkat çekiyor. (Şekil 1)
Cas14’ün karakterizasyonu ayrıca birkaç benzersiz biyokimyasal aktiviteyi de ortaya çıkardı. Sınıf 2 Cas efektörleri, protospacer bitişik motif (PAM) DNA bağlama gereksinimi olarak adlandırılan katı bir özelliğe sahiptir. Tamamlayıcı hedef DNA’ya RNA eşlikli bağlanmanın aksine, PAM bağlanması Cas proteinine bağlanır. Bu nedenle, bir DNA lokusuna bağlanma, hem kılavuz RNA ile DNA hedefi arasındaki tamamlayıcılığı hem de Cas proteininin PAM bağlama elemanları ile etkileşime girebileceği bir konumda hedef DNA bölgesine bitişik uygun PAM sekansını gerektirir. Bu nedenle PAM bağlanması, genomik olarak kodlanmış bir CRISPR-Cas sisteminin kendisini hedeflememesini sağlamak için bir mekanizma sağlar. Kılavuz RNA gen lokusu mutlaka bir PAM sekansına sahip değildir ve aktif bir efektör tarafından tanınamaz. Şaşırtıcı bir şekilde, PAM bağlanmasının Cas efektörlerinin varsayılan bir aktivitesi olduğu göz önüne alındığında, araştırmacılar Cas14 için PAM bağlanma gereksinimi tespit edemedi.
Verilerin Yorumlanması ve Sonuçlar
Bu sonuç mekanik bir soruyu gündeme getirdi: Eğer PAM bağlanma gereksinimi yoksa, Cas14 için gerçek substrat nedir? Burada da araştırmacılar, aktivite tahlilleri Cas14’ün sadece tek iplikli DNA’yı (SSDNA) parçaladığını ve çift iplikli DNA’yı veya tek iplikli RNA’yı parçalamadığını ortaya çıkardığında şaşırtıcı bir sonuç buldular. Cas proteinleri genellikle hedef bağlanmadaki uyumsuzlukları tolere edebilir, ancak PAM bağlanması mutlak bir gerekliliktir; bu nedenle, bu sonuç başka bir mekanik soruyu gündeme getirdi: Cas14, konuma bağlı bir şekilde uyumsuzluklara duyarlı mı? Evet, araştırmacılar, Cas14’ün hassas ve benzersiz bir şekilde olduğunu bulmak için çeşitli ssDNA substratları arasında iki nükleotid uyumsuzluğu döşedi. Diğer Cas proteinlerinden farklı olarak ve bilinmeyen nedenlerden dolayı Cas14, hedef bölgesinin ortasında kabaca 6 bp’lik bir uzantıdaki uyumsuzluklara karşı oldukça hassastır.
Bu özellikler Cas14’ü nükleik asit tespiti için özellikle benzersiz kılar. Son çalışmalar, birçok Cas proteininin, tamamlayıcı bir hedef nükleik asidi bağladıktan sonra trans’da bir oligonükleotidi parçalayabildiğini göstermiştir. Oligonükleotide bir florofor ve söndürücü çiftinin eklenmesi, hedef bağlanmanın floresan habercisi olarak ve dolayısıyla amplifikasyona gerek kalmadan bir nükleik asit sekansı dedektörü olarak işlev görebilir. Doudna ve meslektaşları, Cas14’ün trans bölünme aktivitesine de sahip olduğunu bulmuşlardır. Dahası, Cas14 bir PAM gerektirmediğinden, ancak hedef bölgesinin ortasındaki uyumsuzluklara karşı hala oldukça hassas olduğundan, Cas14 sekans tespiti için benzersiz bir şekilde uygundur. Spesifik olarak, araştırmacılar Cas14’ün, göz renginden sorumlu insan HERC2 varyantları gibi tek nükleotid polimorfizmlerini sağlam bir şekilde ayırt edebildiğini gösterdi.
Bu nedenle, Cas14’e özgü moleküler mekanizmalar, biyoteknolojik uygulamalar için faydalıdır ve daha fazla araştırma için bir dizi önemli soruyu gündeme getirmektedir. Cas14’ün keşfi, Sınıf 2 efektörlerin RuvC benzeri bir atadan ortaya çıktığı hipotezine ampirik bir güven verir. Dahası, diğer Tip V efektörlerin yakın zamanda keşfedilmesiyle desteklendiği gibi, RuvC’yi içeren evrimsel bir görüş, daha fazla varyantın keşfedilmesi için verimli bir yol olabilir. Yine de, bu efektörlerin diğer işlevlerini nasıl kazandıklarını bize anlatmıyor. Gerçekten de, kılavuz RNA bağlanması, hedef tanıma ve PAM bağlanmasının geri kalan aktiviteleri korunmayan alanlardan meydana gelir. Bunlar muhtemelen çeşitli alanların moleküllere özgü bir tarzda toplanması ve uyumlaştırılması yoluyla evrimleşmiştir. Benzer işlevleri paylaşan (örneğin, Cas9 ve Cas12a) bu tür çeşitli mevcut sekansların varlığı, bunun çeşitli yakınsak yollarla cevaplanabilecek bir problem olduğunu göstermektedir. Geleceğe yönelik bir bakışla, Cas14 ve ilgili proteinler tarafından sağlanan evrimsel anlayışların, uygun moleküler biyoloji araçlarıyla birlikte, biyokimyacıların, biyoteknolojik faydalarını geliştirmek ve maksimize etmek için Cas proteinlerinin doğal modülerliğinden yararlanmalarını sağlayacağını daima ediyor.
KAYNAKÇA
- (1) Bhaya, D., Davison, M., andBarrangou, R. (2011) CRISPR-Cassystems in bacteriaandarchaea versatilesmallRNAsforadaptivedefenseandregulation. Annu. Rev. Genet. 45, 273−297.
- (2) Doudna, J. A., andCharpentier, E. (2014) Genomeediting. Thenewfrontier of genomeengineeringwith CRISPR-Cas9. Science 346,1258096.
- (3) Shmakov, S., Smargon, A., Scott, D., Cox, D., Pyzocha, N., Yan,W., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Makarova, K. S., Wolf, Y. I.,Severinov, K., Zhang, F., andKoonin, E. V. (2017) Diversityandevolution of class 2 CRISPR−Cassystems. Nat. Rev. Microbiol. 15,169−182.
- (4) Harrington, L. B., Burstein, D., Chen, J. S., Paez-Espino, D., Ma,E., Witte, I. P., Cofsky, J. C., Kyrpides, N. C., Banfield, J. F., andDoudna, J. A. (2018) Programmed DNA destructionbyminiatureCRISPR-Cas14 enzymes. Science 362, 839−842.
- (5) Yan, W. X., Hunnewell, P., Alfonse, L. E., Carte, J. M., Keston-Smith, E., Sothiselvam, S., Garrity, A. J., Chong, S., Makarova, K. S., Koonin, E. V., Cheng, D. R., andScott, D. A. (2019) Functionallydiversetype V CRISPR-Cassystems. Science 363, 88−91.
- (6) “CRISPR”. Wikipedia, https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR Erişim 04 Mart 2022.
